La passion de Denys Desjardins pour le 7e art prend racine dans sa plus tendre enfance quand, fasciné, il voit son père tourner, monter et projeter de courts films en 8 mm pendant que sa mère travaille à la machine à coudre. C'est dans ce contexte qu'il affirme : « Je suis né de la rencontre entre une machine à coudre et une machine à vue ». Dès lors, le cinéma devient son terrain de jeu et la caméra un outil pour observer et analyser le monde. Pendant ses études universitaires en littérature, en cinéma et en communication, il fonde sa propre compagnie de production, Les Films du Centaure, ce qui lui permet de produire ses premiers courts métrages.

Selon le Dictionnaire du cinéma québécois, il est un "cinéaste touche-à-tout à l'esprit curieux animé par une cinéphilie débordante dont il imprègne la plupart de ses films ». Marqué par la pensée et l'oeuvre des cinéastes Dziga Vertov et Pierre Perrault, Denys Desjardins pratique un « cinéma vécu » basé sur une très longue fréquentation des personnes qu'il filme. Le cinéma, la famille et la continuité entre les générations sont des thèmes récurrents dans ses films comme en témoigne La dame aux poupées (1996), son premier court métrage tourné sur une période de cinq ans à l'île aux Coudres, un des lieux mythique du cinéma québécois.

Avec La dame aux poupées, Desjardins suit les traces du cinéaste Pierre Perrault et pénètre l'univers particulier de la fille de Marie et Alexis Tremblay, les célèbres personnages de Pour la suite du monde (P. Perrault et M. Brault, 1963). Le film de Desjardins film remporte le prix du meilleur court métrage québécois, de l'Association québécoise des critiques de cinéma en 1997, qui lui remettra l'année suivante un autre prix pour son film Contre le temps et l'effacement, Boris Lehman... un portrait de ce cinéaste belge pour qui la vie est une raison de filmer et filmer une raison de vivre.

Denys Desjardins fait ensuite son entrée à l'Office national du film du Canada, où il réalise des films et des sites Internet qui lui permettent de prolonger l'expérimentation cinématographique. Il s'intéresse alors aux différents phénomènes reliés à la vision, vision de l'avenir et de la fin du monde avec Almanach (ONF, 1999) et vision artificielle que procure la caméra avec Mon oeil pour une caméra (ONF, 2001), une autofiction inspirée des théories du cinéaste russe Dziga Vertov. En plus d'une nomination pour le Jutra du meilleur documentaire 2002, ce film a fait l'objet d'une exploration numérique en direct et sur Internet : le Ciné-oeil.

Après avoir coréalisé et produit Moi, Robert « Bob » (2003), il termine Histoire d'être humain (ONF, 2005), un long métrage qui, grâce à l'omniprésence de la caméra du cinéaste, nous permet de suivre plusieurs élèves et professeurs à l'intérieur d'une école publique. En 2006, il produit et coréalise Pierre et le sou (2006), lequel remporte le prix du meilleur court métrage de fiction au Festival Images en vue et Le direct avant la lettre (ONF, 2006), un film qui nous permet de revivre l'éclosion du cinéma documentaire québécois, au tournant des années 50 et 60. Ce film remporte le prix AQCC du meilleur moyen métrage documentaire.

Son plus récent long métrage, Au pays des colons (ONF, 2007), nous entraîne à nouveau sur les traces de Pierre Perrault en compagnie de l'agriculteur et politicien abitibien Hauris Lalancette, personnage central d'une série de films réalisés par Pierre Perrault dans les années 1970. Racontant l'histoire d'une famille de colons qui luttent encore et toujours pour rester sur leur terre, le film revisite du même coup le patrimoine cinématographique légué par les cinéastes québécois qui, à différentes époques, se sont intéressés à cette région. Ce film complété en 2007 est la somme de sept ans de tournage.